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缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护及其机制的初步探讨_图文


中国组织工程研究 第 20 卷 第 37 期

2016–09–09 出版
September 9, 2016 Vol.20, No.37 www.CRTER.org

Chinese Journal of Tissue Engineering Research

·研究原著·

缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护及其机制的初步探讨
张景达,阳富春,阳茂春,刘军廷,胡 广西壮族自治区南宁市 530021) 峰,王静威(广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科,广西医科大学再生医学研究所,

引用本文:张景达,阳富春,阳茂春,刘军廷,胡峰,王静威. 缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护及其机制的初步探

讨[J].中国组织工程研究,2016,20(37):5530-5537.
DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.009 文章快速阅读:
缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护作用
缺血后调适减轻骨骼肌缺血再灌 注损伤, 可能通过激活再灌注损伤 挽救激酶信号通路作用于线粒体 通透性转换孔, 限制其开放, 从而 增强大鼠骨骼肌对缺血再灌注损 伤的耐受能力实现的

ORCID: 0000-0003-3245-2426(阳富春)

右侧股动脉无创 动脉夹夹闭使远 端肢体缺血 4 h

4 个循环 30 s 再灌注/30 s 缺 血

再灌注 24 h

检测大 鼠骨骼 肌组织

张景达, 男, 1987 年生, 广西壮族自治区崇左市 人, 回族, 广西医科大学 在读硕士, 主要从事创伤 修复与功能重建方面的 研究。 通讯作者: 阳富春, 博士, 教授, 广西医科大学第一 附属医院创伤骨科手外 科, 广西医科大学再生医 学研究所, 广西壮族自治 区南宁市 530021
中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2016)37-05530-08 稿件接受:2016-06-20

文题释义: 缺血后调适:又名缺血后处理或缺血后适应,是指在组织缺血后立即施予几个短时程的再灌注/缺血操 作,可以引发内源性保护组织缺血再灌注损伤的现象。研究认为,缺血后调适能介导和激活一系列信号 级联反应,从而减轻由缺血再灌注引起的细胞凋亡与坏死,发挥其保护作用。 缺血后调适方案可降低骨骼肌缺血再灌注损伤:再灌注挽救激酶信号通路主要由 PI3K-Akt 和 MEK1/ 2-Erk1/2 两条重要信号通路组成,再灌注挽救激酶信号通路在缺血预调适和后调适过程中激活了对组 织缺血再灌注损伤保护机制的关键环节。

摘要
背景: 再灌注损伤挽救激酶信号通路在缺血预调适和后调适引发的组织器官缺血再灌注损伤保护机制中 均起重要作用。 目前国内外有关缺血后调适对心肌缺血再灌注损伤保护通路机制的研究较多, 而对骨骼 肌缺血再灌注损伤保护信号通路机制研究较少。 目的:探索后调适方案对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤的保护作用及再灌注损伤挽救激酶通路机制。 方法:将 18 只雄性 SD 大鼠随机等分为缺血再灌注组、缺血后调适组和对照组。缺血再灌注组给予右 侧股动脉无创动脉夹夹闭使远端肢体缺血 4 h,松开再灌注 24 h;缺血后调适组在缺血 4 h 后立即施加 4 个循环 30 s 再灌注/30 s 缺血操作,再灌注 24 h;对照组分离右侧股动脉不予以处理。 结果与结论:①苏木精-伊红染色显示,与缺血再灌注组相比,缺血后调适组骨骼肌纤维结构病理改变 程度较轻,少见炎性灶,肌细胞水肿程度明显改善;②TTC 染色结果显示,缺血后调适组的梗死面积 小于缺血再灌注组;③Western blot 结果显示,缺血后调适组的磷酸化 Akt、磷酸化内皮型一氧化氮合 酶-S1177 蛋白表达量较缺血再灌注组明显增加;而磷酸化内皮型一氧化氮合酶-Thr495 的蛋白表达较 2+ 缺血再灌注组显著降低;④Ca 诱导线粒体通透性转换孔开放测试结果:缺血后调适组线粒体吸光度 的降低程度较缺血再灌注组更为明显。 ⑤结果表明, 缺血后调适能显著减轻大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤, 其机制可能通过激活再灌注损伤挽救激酶信号通路作用于线粒体通透性转换孔, 限制其开放, 从而增强 大鼠骨骼肌对缺血再灌注损伤的耐受能力。 关键词:

组织构建;组织工程;缺血再灌注损伤;骨骼肌;缺血后调适;再灌注损伤挽救激酶通路;Akt;内皮 型一氧化氮合酶;线粒体通透性转换孔;国家自然科学基金
主题词: 肌, 骨骼;再灌注损伤;组织工程 基金资助

广西自然科学基金资助项目(2011GXNSFC018021);国家自然科学基金项目(81260276)

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张景达,等. 缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护及其机制的初步探讨
Zhang Jing-da, Studying for master’s degree, Department of Trauma Orthopedics & Hand Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Institute of Regenerative Medicine of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

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Ischemic post-conditioning protects against ischemia-reperfusion injury in the skeletal muscle: a preliminary research on its mechanism
Zhang Jing-da, Yang Fu-chun, Yang Mao-chun, Liu Jun-ting, Hu Feng, Wang Jing-wei (Department of Trauma Orthopedics & Hand Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Institute of Regenerative Medicine of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China)

Abstract
BACKGROUND: Reperfusion injury salvage kinase (RISK) pathway plays an important role in protective mechanism against ischemia reperfusion injury (IRI) induced by both ischemic pre- and post-conditioning. Many researches have been carried out on RISK pathway mechanism underlying ischemic post-conditioning conferring cardioprotection against IRI; however, there is less research about its effect on IRI in the skeletal muscle. OBJECTIVE: To investigate the protective effect of an optimized protocol of ischemic post-conditioning on IRI in rat skeletal muscle and its underlying mechanism. METHODS: Eighteen male Sprague-Dawley rats were equivalently randomized into IRI, ischemic post-conditioning and control groups. Rats were given occlusion or disocclusion of the right femoral artery of the right lower limb. Subsequently, the IRI group rats were subjected to 24 hours of reperfusion; the ischemic post-conditioning group immediately given 4 cycles of 30 seconds reperfusion/30 seconds ischemia, followed by 24 hours of reperfusion; the control group given no intervention. RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining showed that in the ischemic post-conditioning group, the morphology of muscle fibers changed little, wit h fewer inflammatory lesions and milder edema compared with the IRI group. The infarct size with TTC staining in the ischemic post-conditioning group was smaller than that in the IRI group. Western blot analysis revealed that the expressions of phospho-Akt and phosphorylated endothelial nitric oxide synthase-S1177 were significantly increased, but the expression of phosphorylat ed type endothelial nitric oxide synthase-Thr495 was much decreased in the ischemic post-conditioning group compared with the IRI group. The measurement of mitochondrial permeability transition pore opening with Ca 2+ induction showed that the absorbance values in the ischemic post-conditioning group were significantly lower than those in the IRI group (P < 0.05). These results indicate that ischemia-reperfusion injury can be improved by applying an optimal protocol of ischemic post-conditioning in rat skeletal muscle. The underlying mechanism may be associated with the activation of RISK signaling pathway to inhibit opening of mitochondrial permeability transition pore, thereby contributing to the enhanced tolerance to IRI in rat skeletal muscle. Subject headings: Muscle, Skeletal; Reperfusion Injury; Tissue Engineering Funding: the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2011GXNSFC018021; the National Natural Science Foundation of China, No. 81260276 Cite this article: Zhang JD, Yang FC, Yang MC, Liu JT, Hu F, Wang JW. Ischemic post-conditioning protects against ischemia-reperfusion injury in the skeletal muscle: a preliminary research on its mechanism. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(37):5530-5537.

Corresponding author: Yang Fu-chun, M.D., Professor, Department of Trauma Orthopedics & Hand Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Institute of Regenerative Medicine of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

0 引言 Introduction
骨骼肌缺血再灌注损伤主要指肢体骨骼肌经过一 段时间缺血再灌注后,不仅功能上没有得到恢复,而 且损伤加重的现象,常见于断肢再植、游离肌皮瓣修 复以及骨筋膜室综合征减压等治疗后 ,常导致预后 效果不佳,因此预防或降低缺血再灌注损伤在一定程 度上已成为提高肢体损伤修复后功能不可忽视的重要 环节。 2003年Zhao等 提出了缺血后调适的概念, 即在再
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[2] [1]

灌注前立刻给予一次或多次短暂重复的心肌缺血 /再灌 注,这能减轻心肌后续长时间缺血再灌注损伤的现象。 近10多年来, 缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤影响 的研究不断增多,并从不同方面用不同方案验证其保 护作用
[3-7]

。作者所在团队前期实验对 3 个不同缺血后

调适方案(4个循环 10 s 再灌 /10 s 缺血、4个循环 30 s再 灌/30 s 缺血、4个循环60 s再灌/60 s 缺血)进行比较, 结果显示 4个循环 30 s 再灌/30 s缺血保护效果最好 。 缺血后调适现象自被发现以来,其作用机制一直引发
[8]

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[9]

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研究者浓厚的兴趣, 如 Hausenloy等 发现由促生长因 子 的 磷 脂 酰 肌 醇 3 激 酶 - 蛋 白 激 酶 (phosphatidyl inositol 3-kinase, PI3K-Akt)与有丝分裂原激活蛋白激 酶 p44/p42 细 胞 外 信 号 调 节 激 酶 (extracellular signal-regulated kinase, Erk)1/2共同构成的再灌注损 伤挽救激酶 (reperfusion injury salvage kinase , RISK) 通路,在提高心肌对缺血再灌注损伤的耐受能力中发 挥重要作用。 RISK通路被证实在许多器官组织缺血后调适保护 机制中发挥着重要的作用
[10-11]

缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤影响研究使用的主要试剂及仪器: 试剂及仪器 总Akt、磷酸化Akt一抗 总内皮型一氧化氮合酶、磷酸化内 皮型一氧化氮合酶-S1177一抗 磷酸化内皮型一氧化氮合酶 -Thr495一抗 GAPDH一抗 二抗抗体 TTC 线粒体提取试剂盒 PVDF膜 Odyssey双色红外荧光成像系统 显微镜 紫外分光光度计 来源 Cell Signaling公司 Abcam公司

Santa Crus Biotechnology公司

武汉华美生物技术公司 Cell Signaling公司 北京索莱宝科技有限公司 南京建成生物工程研究所 Millipore公司 美国Licor公司 日本OLYMPUS公司 北京普析T6新世纪公司

。此通路在骨骼肌的缺

血再灌注损伤保护机制中研究较少,尤其在骨骼肌的 缺血后调适作用机制中尚未见类似研究。一氧化氮合 酶是一种存在于哺乳动物细胞的一氧化氮合酶,可分 为内皮型、神经型、诱导型,其中内皮型一氧化氮合 酶不仅在血管内皮细胞持续表达,而且参与了很多重 要的生理功能,如可诱导一氧化氮的生成与释放。生 理剂量的一氧化氮能抑制白细胞黏附、平滑肌细胞增 殖及血小板聚集
[12-14]

1.4 1.4.1 1.4.2

方法 动物分组 大鼠随机等分为3组, 缺血再灌注组、 用2%的

, 并且可以调控活性氧的产生

[15]



而一氧化氮合酶和一氧化氮的改变在缺血再灌注损伤 的病理机制中起关键作用,而对其缺失的干预可以减 轻机体组织的再灌注损伤 中发挥至关重要的作用
[16-17]

缺血后调适组和对照组,各6只。 骨骼肌缺血再灌注损伤及缺血后调适 戊巴比妥钠(70 mg/kg)腹腔内注射麻醉,仰卧位固定于 手术台上。术野常规备皮、消毒、铺巾。分别于右侧腹 股沟处做斜行切口, 依次切开皮肤、 皮下组织、 深筋膜, 显露股动脉、静脉和股神经,分离股动脉。 缺血再灌注组用无创动脉夹夹闭右侧股动脉4 h, 再灌注24 h。缺血后调适组用无创动脉夹夹闭右侧股动 脉 4 h 后紧接着4个循环30 s 再灌注/30 s 缺血,再灌注 24 h。对照组分离右侧股动、静脉后不阻断血流。 股动脉夹闭时可观察到患肢鼠爪由粉红色转变为 暗紫色确认缺血,松夹再灌注患肢鼠爪由暗紫色又转为 粉红色确认血流恢复,并证实无血栓形成后依层缝合切 口(图1)。 1.4.3 取材 大鼠清醒后自由饮食和饮水, 再灌注24 h 后,大鼠麻醉,取材,样本立即使用或放置于-80 ℃冷 冻箱保存。 1.4.4 苏木精-伊红染色 新鲜大鼠比目鱼肌后立即用 冰生理盐水冲洗干净,于 100 g/L 多聚甲醛溶液固定 24 h,并石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色,显微镜 下观察大鼠骨骼肌组织的病理学变化。 1.4.5 TTC 染色 小腿腓肠肌冰冻标本中部横切成 2 mm薄片,PBS(0.1 mol/L)洗3遍,2% TTC溶液37 ℃ 避光浸泡 30 min ,双蒸馏水洗 3 遍。数码相机拍照,
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。研究认为,内皮型一

氧化氮合酶在缺血预调适激发的缺血再灌注损伤保护
[18]

,而在缺血后调适的作用如

何尚不清楚。线粒体通透性转换孔作为再灌注损伤关 键靶点被证实在介导心肌缺血再灌注损伤发挥着重要 作用,有研究表明线粒体通透性转换孔的开放可以导 致线粒体内促凋亡物质释放到细胞质中从而引起细胞 凋亡及死亡
[19]

。作者拟研究优选的缺血后调适方案对

骨骼肌缺血再灌注损伤的保护作用并初步探讨这种保 护作用是否也通过激活 RISK通路,经 PI3K-Akt途径启 动,激活内皮型一氧化氮合酶,最终抑制线粒体通透 性转换孔的开放。

1
1.1 1.2 1.3

材料和方法 Materials and methods
设计 随机对照动物实验。 实验于 2015 年 6 月至 2016 年 2 月在 时间及地点 材料

广西医科大学科学实验中心完成。

实验动物:SPF级健康雄性SD大鼠18只,鼠龄10
周,体质量280-320 g,由广西医科大学实验动物中心 提供,动物许可证号为 SYXK桂2014-0003。动物实验 经广西医科大学第一附属医院伦理委员会审查批准。
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Image-Pro Plus 6.0软件计算梗死面积。梗死面积百分 比(%)=梗死面积/横切片总面积×100%。 1.4.6 Western blot 检测 提取大鼠骨骼肌组织总蛋 白,蛋白定量,-80 ℃保存。取蛋白提取液,进行凝胶 电泳,将蛋白质电转移至PVDF膜上,转膜条件相对分 子质 量 150 000 以 上 300 mA 、 2 h ,相 对分 子质 量 150 000以下200 mA、1 h。室温下体积分数5%胎牛血 清溶液封闭1 h后加入总Akt、总内皮型一氧化氮合酶、 磷酸化Akt、磷酸化内皮型一氧化氮合酶-S1177、磷酸 化内皮型一氧化氮合酶-Thr495、 GAPDH抗体于4 ℃孵 育过夜。洗膜后以对应二抗室温孵育1 h;TBST洗3次。 使用双色红外荧光成像系统进行扫描。采用 Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析蛋白条带的灰度值,以目标 蛋白/GAPDH灰度值比值表示目标蛋白相对表达水平。 1.4.7 线粒体通透性转换孔开放检测
2+

2.3

骨骼肌梗死面积

TTC染色结果显示, 与缺血再灌

注组相比,缺血后调适组大鼠骨骼肌梗死面积明显减 小,差异有显著性意义(P < 0.05),接近于对照组水平 (P > 0.05;图3,表1)。
表 1 缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤大鼠骨骼肌梗死 _ 面积百分比的影响 (x± s,n=6,%) Table 1 Infarct size/total size of the skeletal muscle of ischemia-reperfusion injury rats after ischemic post-conditioning
组别 对照组 缺血后调适组 缺血再灌注组 F P 梗死面积百分比 15.26±7.13 22.27±11.69 43.32±11.44 10.032 0.003

线粒体在 2.4 RISK通路蛋白的表达 Western blot检测结果显
[20]

200 μmol/L Ca 的诱导下,线粒体通透性转换孔开放 导致线粒体水肿、 崩解, 导致在520 nm下吸光度下降
2+



示,各组大鼠骨骼肌中总Akt、总内皮型一氧化氮合酶 的表达差异无显著性意义(P > 0.05),与缺血后调适组 相比,对照组及缺血再灌注组大鼠骨骼肌中磷酸化Akt、 磷酸化内皮型一氧化氮合酶 -S1177 蛋白表达水平明显 下降(P < 0.05),且缺血后调适组大鼠骨骼肌中磷酸化 内皮型一氧化氮合酶-Thr495蛋白表达水平较缺血再灌 注组降低(P < 0.01;图4,表2)。
表 2 缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤大鼠骨骼肌 RISK 通路蛋白表达水平的影响 _ (x±s,n=6,与 GAPDH 灰度值比值) Table 2 Expressions of reperfusion injury salvage kinase pathway proteins in the skeletal muscle of rats with ischemia-reperfusion injury after ischemic post-conditioning
蛋白 总 Akt 对照组 0.764± 0.054 0.487± 0.125 0.253± 0.103a 0.347± 0.188 0.327± 0.165a 缺血后调适组 0.862± 0.027 0.491± 0.060 0.705± 0.199 0.209± 0.176 0.611± 0.123 缺血再灌注组 0.868 ± 0.052 0.536± 0.099 0.182± 0.080a 0.855± 0.251ab 0.185± 0.097a

取部分胫前肌,按说明书提取线粒体溶液,加入 Ca (200 μmol/L)诱导线粒体通透性转换孔开放后,利 用紫外分光光度计检测各组线粒体通透性转换孔吸光 度下降的程度。 1.5 主要观察指标 ①大鼠骨骼肌组织的病理学变 化;②骨骼肌梗死面积;③ PI3K-Akt 通路关键蛋白总 Akt、总内皮型一氧化氮合酶、磷酸化Akt、磷酸化内皮 型一氧化氮合酶 -S1177 及磷酸化内皮型一氧化氮合 酶-Thr495蛋白的表达水平;④线粒体通透性转换孔吸 光度变化。 1.6
_

统计学分析

使用SPSS 21.0软件进行分析, 数据

以x±s表示,各组数据均进行正态检验和方差齐性检验。 组间比较采用方差分析, P < 0.05为差异有显著性意义。

2
2.1 2.2

结果 Results
实验动物数量分析 病理变化 18只SD大鼠无脱落无死亡,

总内皮型一氧化氮 合酶 磷酸化 Akt 磷酸化内皮型一氧 化氮合酶-Thr495 磷酸化内皮型一氧 化氮合酶-S1177

全部进入结果分析。 结果见图 2。苏木精- 伊红染色结果显 示,缺血再灌注组大鼠的部分骨骼肌纤维排列紊乱、断 裂、水解,间隙增宽明显,可见大量白细胞浸润的炎性 灶,大量骨骼肌细胞水肿;缺血后调适组大鼠的骨骼肌 纤维排列稍紊乱,但可见骨骼肌肌纤维,间隙稍增宽, 肌细胞水肿程度较轻,少见炎性灶;对照组大鼠的骨骼 肌纤维结构完整,骨骼肌细胞核排列整齐,肌细胞水肿 少见。
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表注:与缺血后调适组相比,aP < 0.05;与对照组相比,bP < 0.05。

2.5

线粒体吸光度

各组线粒体520 nm处吸光度均有

不同程度的降低,但加入钙离子后2,4,6 min时,缺 血后调适组中线粒体吸光度的降低程度均较缺血再灌 注组更为明显(P < 0.05;表3,图5)。
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A 缺血再灌注组 缺血后调适组 对照组

B

图 1 骨骼肌缺血再灌注损伤及缺血后调适的实验流程及造模方法 Figure 1 The experimental flow chart and modeling method of ischemia-reperfusion injury and ischemic post-conditioning in the skeletal muscle 图注:图 A 为骨骼肌缺血再灌注损伤及缺血后调适的实验流程,图 B 为骨骼肌缺血再灌注损伤及缺血后调适的造模方法。
0.18 A B C 线粒体吸光度 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 a a a a ab 0 2 4 加入 Ca2+后时间(min) 6 a 对照组 缺血后调适组 缺血再灌注组

图 2 缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤大鼠骨骼肌病理变化 的影响(苏木精-伊红染色,×200) Figure 2 Morphological changes of the skeletal muscle of ischemia-reperfusion injury rats after ischemic post-conditioning (hematoxylin-eosin staining, x200) 图注:图中 A 为对照组;B 为缺血后调适组,大量骨骼肌细胞胞 核出现水肿(黑色箭头);C 为缺血再灌注组,骨骼肌纤维断裂、 水解(红色箭头),大量白细胞浸润(绿色箭头)。
A 对照组 B 60 a 梗死面积(%) 40

0

图 5 在 200 μmol/L Ca2+诱导下缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注 损伤大鼠骨骼肌线粒体吸光度的变化 Figure 5 Changes of 200 μmol/L Ca2+-induced mitochondrial absorbance values in rat skeletal muscle of ischemiareperfusion injury after ischemic post-conditioning
a b 图注: 与缺血后调适组相比, P < 0.05; 与对照组相比, P < 0.05

图 3 缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤 大鼠骨骼肌梗死面积的影响 Figure 3 The infarct size of the skeletal muscle of ischemia reperfusion injury rats after ischemic post-conditioning
20

缺血后调适组

图注:图中 A 为各组大鼠骨骼肌梗死面积, 红色为正常组织,灰白色为梗死区(黑色箭 头);B 为梗死面积百分比。与缺血后调适组 相比,aP < 0.05。

缺血再灌注组

0 对照组 缺血后调适组 缺血再灌注组

对照组

缺血后调适组

缺血再灌注组

A

总 Akt GAPDH 磷酸化 Akt

B

总 Akt

总内皮型一氧化氮合酶

磷酸化 Akt

磷酸化内皮型一氧 化氮合酶-Thr495 1.2 目标蛋白相对表达水平 (与 GAPDH 灰度值的比值) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 对照组 a a

磷酸化内皮型一氧化氮 合酶-S1177 ab

GAPDH 总内皮型一氧化氮合酶 GAPDH 磷酸化内皮型一氧化氮合酶-S1177 GAPDH 磷酸化内皮型一氧化氮合酶-Thr495 GAPDH

a

a

缺血后调适组

缺血再灌注组

图 4 缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤大鼠骨骼肌 RISK 通路蛋白表达的影响 Figure 4 Expressions of proteins on the reperfusion injury salvage kinase pathway of skeletal muscle of ischemia reperfusion injury in rat skeletal muscle after ischemic post-conditioning 图注:图中 A 为 Western blot 检测 RISK 通路蛋白的表达;B 为 RISK 通路蛋白的表达水平。与缺血后调适组相比,aP < 0.05;与对照 组相比,bP < 0.05。

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表 3 缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤大鼠骨骼肌线粒 _ 体吸光度的影响 (x± s,n=6) Table 3 Mitochondrial absorbance values of ischemiareperfusion injury rats after ischemic post-conditioning
组别 加入Ca2+后时间(min) 0 对照组 缺血后调 适组 缺血再灌 注组 表注:与缺血后调适组相比, P < 0.05;与对照组相比, P < 0.05。
a b

明缺血后调适可能通过激活 Akt-内皮型一氧化氮合酶一氧化氮信号通路而发挥其保护作用。有趣的是,实验 中缺血再灌注组磷酸化内皮型一氧化氮合酶 -Thr495 (Thr495) 的 表 达 较 缺 血 后 调 适 组 高 。 有 研 究 显 示 , Thr495 与 S1177 的作用恰恰相反, Thr495 是一种存在

2
a

4
a

6

于钙调素结合蛋白的苏氨酸残基,长期处于磷酸化,而 磷酸化的 Thr495 可以使 S1177 去磷酸化,从而使内皮 型一氧化氮合酶处于失活状态,抑制一氧化氮的产 生
[23-25]

0.136±0.017 0.086±0.012 0.057±0.007 0.035±0.007a 0.104±0.011 0.075±0.014 0.064±0.011 0.051±0.012 0.096±0.009 0.050±0.010 0.029±0.007 0.016±0.006
a a ab

。可能的原因是磷酸化的 Thr495 阻碍了内部电
[25-26]

子的流动,从而抑制了 L-精氨酸氧化成 L-瓜氨酸和一 氧化氮的过程 。实验结果表明,缺血后调适可能通 过某种机制使内皮型一氧化氮合酶-Thr495 去磷酸化而

3

讨论 Discussion
作者所在团队前期通过设计不同缺血后调适方案

使内皮型一氧化氮合酶得以活化。而有研究表明 RhoA/Rho- kinase 通路一方面可以通过抑制 Akt 磷酸 化,从而抑制 PI3K-Akt 下游的 Ser1177 磷酸化使内皮 型一氧化氮合酶失活,另一方面又可通过 Thr495 磷酸 化而使内皮型一氧化氮合酶失活 氧化氮合酶的活化
[28] [27]

(即 4 h 缺血后立即施加 4 个循环 10 s 再灌注/10 s 缺血、 30 s 再灌注/30 s 缺血、60s 再灌注/60 s 缺血的后调适 操作)研究显示,缺血后调适能不同程度骨骼肌水肿, 降低血清乳酸脱氢酶水平,同时降低骨骼肌组织髓过 氧化物酶、丙二醛水平,从而减轻大鼠骨骼肌缺血再 灌注损伤 。实验研究用优选的缺血后调适方案进一 步探讨其对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤的影响。 TTC 染色结果显示,相比缺血再灌注组,缺血后调适能有 效小骨骼肌梗死面积; 苏木精 - 伊红染色结果也显示与 缺血再灌注组相比,缺血后调适组的肌细胞水肿程度 明显减轻及肌纤维病理学损伤改变明显改善,进一步 证实缺血后调适能提高骨骼肌对缺血再灌注损伤的耐 受性。 缺血后调适是针对已经缺血的组织或器官于缺血 结束再灌注初期给予多次短时的缺血再灌注的处理,临 床上有其潜在应用可能性。一方面,在骨外科手术中比 较常见,如断肢再植、游离肌皮瓣移植、骨筋膜室综合 征减压后及长时间使用止血带松开时等。另一方面,因 为缺血后调适操作本身可能对所施加操作的器官或组 织造成潜在(尽管可能微不足道)的损害,因而探究其保 护作用机制以应用于临床其实更有意义。RISK 通路是 一条具有广泛调控作用的信号通路,其通路过程主要有 PI3K 激活 Akt,再启动下游保护性信号级联,尽管下游 通路仍未完全弄清楚,但活化的 Akt(即磷酸化 Akt) 通 过磷酸化内皮型一氧化氮合酶促进内源性一氧化氮生 成是其中一条重要的途径
[21-22] [8]

。另外,蛋白激酶 C

也可能参与了 Thr495 的磷酸化过程从而抑制内皮型一 。Thr495 在骨骼肌缺血再灌注损 伤机制中发挥着某种重要的作用, 而 S1177 的磷酸化和 内皮型一氧化氮合酶的活化与缺血后调适引发骨骼肌 缺血再灌注损伤保护密切相关。其内在机制有待进一步 研究。 线粒体通透性转换孔为存在于线粒体膜,是一种非 特异性的电压和钙离子依赖通道
[29]

。氧化应激、钙离子

超载、ATP 的过度损耗都能使其开放,导致线粒体电位 梯度的消失,氧化磷酸化的解偶联, ATP 消耗/产生失 去平衡,这些因素导致了线粒体结构的不稳定,线粒体 结构的变化亦可以使以上情况恶化,这种级联的正反馈 最终导致了线粒体肿胀、崩解,释放细胞色素 C 诱导细 胞凋亡和坏死
[30]

。有研究表明,线粒体通透性转换孔是
[31-32]

RISK 信号通路的终末效应器

。 实验利用 Ca 诱导骨

2+

骼肌线粒体通透性转换孔开放, 结果表明, 与缺血再灌注 组相比,缺血后调适组线粒体吸光度在 2,4 及 6 min 时 下降程度均比缺血再灌注组小,说明缺血后调适可能通 过激活 RISK 信号通路抑制下游线粒体通透性转换孔 的开放而减轻骨骼肌缺血再灌注损伤。但是 RISK 信 号通路抑制细胞线粒体通透性转换孔开放的机制尚不 明确,而有研究表明,在缺血的组织再灌注的最初几 分钟,线粒体基质钙离子过载和活性氧族的爆发是导 致线粒体通透性转换孔开放的主要原因,而低 pH 值 却能抑制线粒体通透性转换孔的开放
[33]

。Western Blot 结果提示

缺血后调适组中活化的磷酸化 Akt、磷酸化内皮型一氧 化氮合酶-S1177 表达量较缺血再灌注组明显增多,说
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,其具体的机
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张景达,等. 缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护及其机制的初步探讨

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制尚需深入研究。 实验显示缺血后调适通过激活 RISK 机制,特别是 PI3K-Akt 信号通路,活化内皮型一氧化 氮合酶,最终抑制线粒体通透性转换孔开放而降低缺 血再灌注损伤。 综上所述,缺血后调适能显著减少骨骼肌缺血再灌 注的损伤,其作用机制可能通过部分或完全激活 RISK 信号通路作用于线粒体通透性转换孔,限制其开放,从 而增强骨骼肌对缺血再灌注损伤的保护作用。

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+

作者贡献:张景达进行动物实验具体实施、实验取材、
指标检测、资料收集、分析及论文撰写;阳富春进行实验 总体设计和实施指导、实验评估、资料分析、以及论文撰 写审校;阳茂春进行实验检测分析,刘军廷、胡峰、王静 威进行动物实验、资料分析及统计分析。
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利益冲突:所有作者共同认可文章内容不涉及相关利
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伦理问题:动物实验方案经广西医科大学第一附属医
院伦理委员会批准, 批准号为伦审 2012 第(KY-192)号。 实 验动物在戊巴妥纳麻醉下进行所有手术,并尽一切努力最 大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

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